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研究生: 黃汶函
Huang, Wun-Han
論文名稱: 開發GSK-3β抑制劑作為治療阿茲海默症新藥
Discovery of novel GSK-3β inhibitors for Alzheimer's disease
指導教授: 李冠群
Lee, Guan-Chiun
學位類別: 碩士
Master
系所名稱: 生命科學系
Department of Life Science
論文出版年: 2015
畢業學年度: 103
語文別: 中文
論文頁數: 66
中文關鍵詞: 阿茲海默症肝醣合成酶激酶酵素抑制劑虛擬藥物篩選分子動力學模擬
英文關鍵詞: Alzheimer's disease, GSK-3β, enzyme inhibitor, virtual screening, MD simulation
論文種類: 學術論文
相關次數: 點閱:154下載:27
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  • 阿茲海默症是目前最常見的一種失智症,為一種不可逆的神經退化性疾病,會造成記憶與行為上的缺失,以及人格的改變,有兩個主要的病徵,分別是類澱粉斑(Amyloid plaques)和神經纖維纏結(Neurofibrillary tangles, 簡稱NFTs),於罹患阿茲海默症之病人腦部發現。GSK-3β蛋白磷酸化tau蛋白會促使NFTs形成,在阿茲海默症中扮演很重要的角色,因此抑制GSK-3β蛋白之活性會是一個治療阿茲海默症的方式。我們與本校化學系孫英傑老師合作,利用電腦輔助藥物設計及分子間作用力分析技術,開發GSK-3β抑制劑作為治療阿茲海默症新藥。為了獲得足夠的GSK-3β進行抑制劑之篩選,我們構築了含人類GSK-3β基因的質體,並於多株不同的大腸桿菌宿主中表達,然而GSK-3β卻形成了包涵體(Inclusion body),為此,我們將蛋白表達的條件進一步優化,以及進行蛋白的重折疊(Protein refolding),期望能獲得可溶的蛋白,然而卻依然無法提升蛋白的溶解度。因此,在本研究中,我們購買了GSK-3β蛋白進行抑制劑之篩選,在電腦模擬篩選出的三十八個藥物中,我們以抑制後蛋白殘餘活性在百分之六十五以下為篩選標準,共篩選出了三個抑制劑,這些抑制劑有潛力能成為治療阿茲海默症之藥物。

    Alzheimer's disease (AD) is the most common form of dementia in the elderly. AD is a progressive and irreversible neurodegenerative disorder that results in significant memory loss and behavioral and personality changes. The two hallmarks of AD, the amyloid plaques and neurofibrillary tangles (NFTs) are found in the brain of those with a diagnosis of AD. Hyperphosphorylation of tau by GSK-3β plays a crucial role in NTF formation. As GSK-3β activation is a critical step in the cascade of detrimental events in AD, therapeutics targeted to inhibiting GSK-3β may be beneficial in the treatment of this devastating disease. In the present study, computer modeling (by Dr. Ying-Chieh Sun) and experimental analysis were used to assist discovery/design of GSK-3β inhibitors. To obtain sufficient enzyme sample for the inhibitor screening, human GSK-3β gene has been cloned and expressed in several E. coli strains. However, the recombinant GSK-3β was expressed as inclusion bodies. Conditions of protein expression and protein refolding were further optimized to express active soluble protein and still cannot improve the solubility of recombinant GSK-3β. GSK-3β assay has been established by using commercial human GSK-3β to screen for potent inhibitors. Three of the 38 compounds predicted by computer modeling have been tested to be potent inhibitors with a residual activity lower than 65% of the activity without inhibitor. These three inhibitors could be applied in the treatment of AD.

    表目錄 V 圖目錄 VI 附錄 VII 摘要 VIII Abstract IX 壹、緒論 1 一、 神經退化性疾病 1 二、 阿茲海默症(Alzheimer's disease) 1 三、 Glycogen synthase kinase-3β(GSK-3β) 3 (一) GSK-3β蛋白簡介 3 (二) GSK-3β對於阿茲海默症之重要性 4 (三) GSK-3β抑制劑之研發 5 四、 ADP-GloTM Kinase Assay 6 貳、研究目的 8 參、研究方法 9 一、 人類GSK3之全長cDNA的取得 9 二、 大腸桿菌菌株 9 三、 重組質體之建構 9 (一) 重新建構pET23a-GSK3b重組質體 9 (二) 建構pMAL-c2X-GSK3重組質體 13 四、 重組蛋白之表達 15 (一) 重組質體之轉型 15 (二) 蛋白表達 16 (三) 蛋白質電泳分析 16 五、 蛋白重摺疊(Protein refolding) 19 (一) 沉澱蛋白之溶解 19 (二) 回溶之蛋白純化 19 (三) 蛋白重摺疊 20 (四) 重摺疊蛋白之活性分析 20 六、 藥物篩選系統之建立 21 (一) GSK3b活性抑制測試 21 (二) GSK3b抑制劑之作用分析 22 肆、結果 27 一、 人類GSK3蛋白表達 27 (一) 重組蛋白表達條件之優化 27 (二) 融合蛋白表達系統-pMAL™ Protein Fusion and Purification System 28 二、 蛋白重摺疊(Protein refolding) 30 三、 藥物篩選 31 (一) GSK3抑制劑篩選 31 (二) GSK3活性抑制測試 32 (三) GSK3抑制劑之IC50 32 (四)分析GSK3b抑制劑作用機制 33 伍、討論 34 一、蛋白質表達 34 二、蛋白重摺疊 37 三、藥物篩選 38 陸、參考文獻 41 表目錄 表 一、 本研究所使用的引子序列 43 表 二、 本研究所使用的大腸桿菌菌種 44 表 三、pMAL-c2X-GSK3b重組質體於大腸桿菌 K12 TB1菌株,蛋白表達之條件 45 表 四、 GSK3b抑制劑之IC50和於0.018 mM濃度時GSK3β的殘餘活性 46 圖目錄 圖 一、 pET23a-GSK3b重組質體圖譜 47 圖 二、 pMAL-p2X(c2x)-GSK3b重組質體圖譜 48 圖 三、 pET23a-GSK3b蛋白表達 49 圖 四、 pET23a-GSK3b蛋白表達優化-降低表達溫度及IPTG濃度 50 圖 五、 pET23a-GSK3b蛋白表達優化—更換大腸桿菌宿主和降低表達溫度 52 圖 六、 pMAL-P2X-GSK3b蛋白表達優化-以MBP蛋白增加溶解度 54 圖 七、 pMAL-c2X-GSK3b蛋白表達優化-以MBP蛋白增加溶解度 56 圖 八、 GSK3b蛋白重摺疊及測試活性 57 圖 九、 GSK3b活性抑制測試 60 圖 十、 測試GSK3b抑制劑之IC50 61 圖 十一、分析GSK3b抑制劑作用機制 62 附錄 附錄一、 (A) GSK-3β抑制劑於不同疾病之藥物專利(B) GSK-3β抑制劑相關的專利數量 63 附錄二、 ADP-GloTM Kinase Assay 64 附錄三、 pMAL-c2X-GSK3b重組質體於大腸桿菌 K12 TB1菌株,蛋白表達膠圖 65

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