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研究生: 黃宇鋒
論文名稱: 以材料角度探討金奈米粒子對siRNA的保護性
Preparation of Gold Nanoparticles and Their Investigation in siRNA Protection
指導教授: 黃宇鋒
學位類別: 碩士
Master
系所名稱: 化學系
Department of Chemistry
論文出版年: 2007
畢業學年度: 95
語文別: 中文
論文頁數: 48
中文關鍵詞: siRNA金奈米粒子基因傳輸基因治療
論文種類: 學術論文
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  • RNAi的機制之中,siRNA可以用來抑制目標基因的表現。RNAi也在近年來迅速成為功能性調節基因的工具,並且在基因治療的應用上佔有重要的地位。然而利用siRNA作為基因抑制的成功關鍵,便是在於其能否有效的傳送到細胞內。因此,安全並且有效的siRNA傳輸系統是現在迫切需要的。
    在本實驗中,我們合成4.5nm的正電荷金奈米粒子,表面以thiocholine包覆。此材料展現出與siRNA很好的結合能力,並且能夠中和siRNA的電性。作為一個siRNA的載體,金奈米粒子對於siRNA擁有很好的保護能力。我們同時也發現siRNA的釋放與PH值有很大的關係,因此我們可以預測我們的材料在細胞內的siRNA釋放的情況。我們也研究金奈米粒子在不同濃度與不同回復時間之下對於細胞的毒性極低。我們結論是表面修飾有thiocholine的金奈米粒子擁有對siRNA良好的保護能力,並在做為基因載體上有很大的潛力。

    Short interfering RNA (siRNA) can be used to regulate expression of the targeted gene functionalized as RNA interference (RNAi). RNAi has rapidly become a popular tool for functional genomics research and target gene validation, and holds great promise for therapeutic applications as well. However, the successibility of gene silencing applications based on the use of synthetic siRNA depends on the probability of delivery system. Therefore, the development of save and efficient siRNA delivery systems is of urgent.
    In this study, we synthesized 4.5 nm gold nanoparticles (AuNPs) with positive charge by coating with thiocholine capped groups. The AuNPs exhibited good capacity in forming of Au-siRNA complex by neutralizing the surface charge of siRNA. As a siRNA carrier, AuNPs performed distinguishable ability in siRNA protection. We also show that the release of siRNA on gold nanoparticles is response to pH, so we can predict the release condition of siRNA in cells. We have investigated the cytotoxicity of Gold nanoparticles at different concentrations and recover times, and the results show that gold nanporticles are nontoxic to living cells. In conclusion, thiocholine capped gold nanoparticles show good ability to protect siRNA and have capability for gene delivery.

    總目錄…………………………………………………………………Ⅰ 圖表目錄………………………………………………………………Ⅲ 中文摘要………………………………………………………………Ⅴ 英文摘要………………………………………………………………Ⅵ 第一章:序論………………………………………………………… 1 1-1 引言…………………………………………………………… 1 1-2 奈米材料簡介………………………………………………… 2 1-3 金奈米粒子合成……………………………………………… 4 1-4 金奈米粒子的特性及在生醫上的應用……………………… 6 1-5 基因傳輸系統………………………………………………… 7 1-5.1 物理方法………………………………………………… 9 1-5.2 病毒載體系統…………………………………………… 9 1-5.3 非病毒載體………………………………………………11 1-6 RNA干擾現象………………………………………………… 14 第二章:實驗…………………………………………………………17 2-1 實驗動機………………………………………………………17 2-2 藥品與儀器……………………………………………………19 2-3 實驗步驟………………………………………………………20 2-3.1 合成正電荷金奈米粒子…………………………………20 2-3.2 培養含增強型綠色螢光蛋白(EGFP)的細胞…………22 2-3.3 金奈米材料結合siRNA………………………………… 22 2-3.4 找不同濃的之金奈米粒子溶液對siRNA的結合效率…23 2-3.5 不同pH值與溫度對於金奈米粒子-siRNA之影響…… 23 2-3.6 金奈米粒子對siRNA保護性的測試……………………24 2-3.7 金奈米粒子對於細胞毒性的測試………………………24 第三章:結果與討論…………………………………………………27 3-1 正電荷金奈米粒子之性質分析………………………………27 3-2 正電荷金奈米粒子與siRNA的鍵結效率……………………29 3-3 不同pH之下對於金奈米粒子-siRNA複合物的影響……… 32 3-4 金奈米粒子對siRNA保護性…………………………………39 3-5 金奈米粒子的細胞毒性………………………………………42 第四章:結論…………………………………………………………44 第五章:未來展望……………………………………………………45 參考資料………………………………………………………………46 圖表目錄 圖1-1 量子限量化效應。…………………………………………… 3 圖1-2 檸檬酸法合成金奈米粒子。………………………………… 5 圖1-3 Brust的合成方式合成金奈米粒子。 ……………………… 5 圖1-4 (A)金奈米粒子修飾不同片段的DNA可以經雜交使其聚集。 (B)經DNA雜交後的金奈米粒子因聚集而產生變色。…… 7 圖1-5 微脂粒做為基因載體示意圖。………………………………12 圖1-6 正電荷高分子(PAMAM)結構式。 …………………………13 圖1-7 RNAi機制。……………………………………………………16 圖2-1 實驗概念示意圖。……………………………………………18 圖2-2 MTT反應原理。………………………………………………25 圖3-1 金奈米粒子的TEM圖。………………………………………28 圖3-2 金奈米粒子的UV吸收光譜。 ………………………………28 圖3-3 金奈米粒子與siRNA複合物的膠體電泳照片。……………30 圖3-4 由圖3-3每條band相對於Marker的亮度分析結果。 ……30 圖3-5 不同濃度的金奈米粒子與等量siRNA形成複合物的表面電位 (Zeta potential)。…………………………………………31 圖3-6 37℃之下金奈米粒子-siRNA在不同pH值的DMEM之下的膠體 電泳圖。 ………………………………………………………33 圖3-7 由圖3-6每條band相對於Marker的亮度分析結果。 ……33 圖3-8 siRNA在不同pH值的DMEM之下的膠體電泳圖。 …………34 圖3-9 由圖3-8每條band相對於Marker的亮度分析結果。 ……34 圖3-10 4℃之下金奈米粒子-siRNA在不同pH值的DMEM之下的膠體 電泳圖。………………………………………………………35 圖3-11 由圖3-10每條band相對於Marker的亮度分析結果。……35 圖3-12 37℃之下金奈米粒子-siRNA在不同pH值的DMEM之下的吸  收光譜。………………………………………………………37 圖3-13 4℃之下金奈米粒子-siRNA在不同pH值的DMEM之下的吸收 光譜。…………………………………………………………37 圖3-14 金奈米粒子-siRNA在不同pH值的DMEM之TEM圖。 ……38 圖3-15 金奈米粒子-siRNA與RNase A作用不同時間的膠體電泳 圖。 …………………………………………………………40 圖3-16 由圖3-15每條band相對於Marker的亮度分析結果。……40 圖3-17 Free siRNA與RNase A作用不同時間的膠體電泳圖。……41 圖3-18 由圖3-17每條band相對於Marker的亮度分析結果。……41 圖3-19 餵食不同金奈米粒子濃度下對於細胞的存活率測試。……42 圖3-20 細胞餵食金奈米粒子490nM,4小時後不同的回覆時間的細     胞存活率。 …………………………………………………43

    (1) (a) Alivisatos, P. Nat. Biotechnol. 2004, 22, 47. (b) West, J. L.; Halas,
    N. J. Curr. Opin. Biotechnol. 2000, 11, 215. (c) Parak, W. J.; Gerion,
    D.; Pellegrino, T.; Zanchet, D.; Micheel, C.; Williams, S. C.;
    Boudreau, R.; Le Gros, M. A.; Larabell, C. A.; Alivisatos, A. P.
    Nanotechnology 2003, 14, R15. (d) Chan, W. C. W.; Maxwell, D. J.;
    Gao, X.; Bailey, R. E.; Han, M.; Nie, S. Curr. Opin. Biotechnol.
    2002, 13, 40. (e) Drummund, T. G.; Hill, M. G.; Barton, J. K. Nat.
    Biotechnol. 2003, 21, 1192. (f) Willner, I.; Patolsky, F.; Weizmann,
    Y.; Willner, B. Talanta 2002, 56, 847. (g) Niemeyer, C. M. Angew.
    Chem., Int. Ed. 2001, 40, 4128.
    (2) Astruc, D.; Daniel, M.-C. Chem. Rev. 2004, 104, 293.
    (3) Fire, A. ; Xu, S. Q.; Montgomery, M. K.; Kostas, S. A.; Driver, S. E.;
    Mello, C. C. Nature 1998, 391, 806.
    (4) (a) Andres, R. P.; Bein, T.; Dorogi, M.; Feng, S.; Jenderson, J. I.;
    Kubiak, C. P.; Mahoney, W.; Osifchin, R. G.; Reifenverger, R.
    Science 1996, 272, 1323. (b) Toshima, N.; Yonezawa, T. Bimetallic
    New J. Chem. 1998, 1179. (c) Fendler, J. H. Chem. Mater. 1996, 8,
    1616.(d) Henglein, A. J. Phys. Chem. 1993, 97, 5457. (e) Belloni, J.
    Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 1996, 1, 184.
    (5) Alivisatos, A. P. Science 1996, 271, 933.
    (6) Turkevitch, J.; Stevenson, P. C.; Hillier, J. Faraday Soc. 1951, 11, 55.
    (7) Yonezawa, T.; Kunitake, T. Colloids Surf. A: Physicochem. Eng. Asp.
    1999, 149, 193.
    (8) Elghanian, R.; Storhoff, J. J.; Mucic, R. C.; Letsinger, R. L.; Mirkin,
    C. A. Science 1997, 277,1078.
    (9) (a) Williams, D. A.; Baum, C. Science 2003, 302, 400. (b)
    Cavazzana-Calvo M.; Thrasher A.; Mavilio F. Nature 2004, 427, 779.
    (10) Verma, I. M.; Somia, N. Nature 1997, 389, 239.
    (11) Luo, D.; Saltzman, M. W. Nature Biotechnol. 2000, 18, 33
    (12) (a) Boyce, N. Nature 2001, 414, 677. (b) Check, N. Nature 2002,
    420, 116.
    (13) (a) Hamilton, A. J.; Baulcom, D. C. Science 1999, 286, 950. (b)
    Bernstein, E. et al. Nature 2001, 409, 363.
    (14) Brummelkamp, T. R. et al. Science 2002, 296, 550.
    (15) Zhou, J.; Wu, J.; Hafdi, N.; Peng, L. Chem. Commun., 2006, 7, 2362
    (16) Niidome, T. Chem. Commun., 2004, 5, 1978.
    (17) Kawano, T.; Niidome, Y.; Katayama, Y.; Niidome, T. Molecular
    Therapy 2005, 11, S84
    (18) Choi, J. S.; Lee, E. J.; Jang, H. S.; Park, J. S. Bioconjugate Chem.;
    2001, 12, 108.

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