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研究生： 柯嘉玲
論文名稱： 具α-2,3-Sialyltransferase功能性之磁性奈米粒子及其應用
α-2,3-Sialyltransferase Functionalized Magnetic Nanoparticle and its Application
指導教授： 陳焜銘
Chen, Kwun-Min
林俊成
Lin, Chun-Cheng
學位類別： 碩士
Master
系所名稱： 化學系
Department of Chemistry
論文出版年： 2006
畢業學年度： 95
語文別： 中文
中文關鍵詞： α-2,3-sialyltransferase 、magnetic nanoparticle 、intein
論文種類： 學術論文
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    • 本論文中為發展蛋白質的快速純化和酵素的重複使用，以pTYB1及pTXB1此intein系列之載體分別表達，eGFP-intein及α-2,3-sialyltransferase-intein這兩種融合蛋白，利用intein 之特性，分別在eGFP及α-2,3-sialyltransferase之C端進行修飾，以利其專一位相固化於磁性奈米粒子上。透過磁鐵與磁性奈米粒子之間的磁力吸引，可從表現完之混合蛋白質，快速的純化出eGFP及α-2,3-sialyltransferase。不需要繁瑣的更換緩衝溶液系統，和長時間的純化步驟，目標蛋白質可快速地固化於磁性奈米粒子上，並可透過磁鐵純化。我們亦證明固化後之酵素活性並無改變，且在酵素反應完之後，可快速將酵素與反應物分離，回收的酵素可再利用，更加符合經濟效應。

    目錄．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．I 圖表目錄．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．IV 簡寫表．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． VII 摘要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．IX 第一章 序論．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 01 1-1磁性粒子於生物科技應用．．．．．．．．．．．．．．．．01 1-2醣類與細胞間之辨識．．．．．．．．．．．．．．．．．．02 1-3唾液酸 (sialic acid)．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 05 1-4唾液酸轉移酶 (α-2,3-sialytransferase ,α-2,3-SiaT)應用．．．．． 06 1-5蛋白質專一性 (site-specific)的固定．．．．．．．．．．．．08 1-6 intein於生物科技應用．．．．．．．．．．．．．．．．．．11 1-7唾液酸轉移酶 (α-2,3-sialytransferase )的固定．．．．．．．．13 第二章 結果與討論．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．15 2-1合成6-(Dansyl)-aminohexyl O-β-D-galactopyranosyl- (1,4)-β-D-glucopyranoside．．．．．．．．．．．．．．．．15 2-2建構含α-2,3 SiaT 酵素基因的重組載體 (recombinate DNA) ．16 2-2-1引子設計．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．17 2-2-2聚合酶鏈反應 (polymerase chain reaction,PCR)的條件．．．19 2-2-3 T-A cloning．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．23 2-2-4確定DNA序列使用之方法．．．．．．．．．．．．．．．28 2-2-5 α-2,3 SiaT-pTXB1建立重組載體．．．．．．．．．．．．29 2-3 α-2,3-sialytransferase (α-2,3-SiaT)的表現與純化．．．．．．．33 2-3-1 α-2,3-SiaT於pTXB1及pTYB1的表現差異．．．．．．．．37 2-3-2 IPTG 調控蛋白質的表現．．．．．．．．．．．．．．．．39 2-4 α-2,3 SiaT活性測試．．．．．．．．．．．．．．．．．．40 2-4-1 α-2,3 SiaT酵素反應的pH值最佳化．．．．．．．．．．．43 2-5目標蛋白固化 (the immobilization of target protein) ．．．．．44 2-5-1 eGFP重組載體建構．．．．．．．．．．．．．．．．．．44 2-5-2 eGFP的表現與純化．．．．．．．．．．．．．．．．．．47 2-5-3螢光蛋白的固化．．．．．．．．．．．．．．．．．．．51 2-5-4固化於磁性奈米粒子的eGFP定量．．．．．．．．．．． 52 2-5-5 α-2,3 SiaT的固化．．．．．．．．．．．．．．．．．．．53 2-5-6固化於磁性奈米粒子的α-2,3 SiaT定量．．．．．．．．．．56 2-5-7固化前與固化後的α-2,3 SiaT活性比較．．．．．．．．．．57 2-5-8固化於磁性奈米粒子的α-2,3 SiaT的重複使用性．．．．．．60 2-6結論．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．62 第三章 實驗材料與方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．63 3-1一般實驗方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．63 3-2實驗步驟及光譜資料．．．．．．．．．．．．．．．．．．64 3-3 pH值最佳化之酵素反應．．．．．．．．．．．．．．．．．66 3-4固化前與固化後的α-2,3 SiaT活性比較．．．．．．．．．．67 3-5固化後的α-2,3 SiaT重複使用．．．．．．．．．．．．．．68 3-6菌株、質體與培養基．．．．．．．．．．．．．．．．．．68 3-7 E.coli 質體DNA抽取．．．．．．．．．．．．．．．．．．69 3-8洋菜膠體上的DNA片段回收與純化．．．．．．．．．．．71 3-9 DNA黏接反應 (ligation) ．．．．．．．．．．．．．．．．72 3-10質體轉形作用．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．73 3-10-1勝任細胞 (competent cell)之製備．．．．．．．．．．．．73 3-10-2轉型作用 (Transformation) ．．．．．．．．．．．．．．73 3-11 DNA 膠體電泳．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．74 3-12融合酵素蛋白的表現及純化分析．．．．．．．．．．．．．76 3-13 SDS-PAGE膠體電泳．．．．．．．．．．．．．．．．．．79 3-14蛋白質的定量分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．81 參考文獻．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．82 附錄．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．90

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